體外擴(kuò)增已分選的 T 細(xì)胞，需在保證細(xì)胞數(shù)量充足的同時(shí)，維持其良好的活性與功能，過(guò)程中諸多細(xì)節(jié)需精準(zhǔn)把控。
一、體外擴(kuò)增 T 細(xì)胞的關(guān)鍵注意要點(diǎn)
分選后的 T 細(xì)胞純度需達(dá)到 90% 以上，防止其他細(xì)胞（如 B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞）混入，避免因爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)而干擾擴(kuò)增。同時(shí)要關(guān)注細(xì)胞活力，當(dāng)活細(xì)胞比例低于 80% 時(shí)，擴(kuò)增效率會(huì)顯著下降，可通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色或流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
T 細(xì)胞的活化和增殖離不開(kāi)細(xì)胞因子，IL-2 是常用的一種，但過(guò)量使用會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞耗竭或分化為調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（Treg），進(jìn)而影響擴(kuò)增效果。目前常聯(lián)合使用 IL-7、IL-15 等，既能促進(jìn)增殖，又能維持細(xì)胞特性。需根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)調(diào)整濃度，例如初始階段 IL-2 濃度可設(shè)為 500-1000 U/mL，后期逐步降低。
培養(yǎng)體系的無(wú)菌與營(yíng)養(yǎng)平衡
全程需嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作，定期檢測(cè)培養(yǎng)基 pH 值（維持在 7.2-7.4）和葡萄糖濃度，當(dāng)葡萄糖低于 2 g/L 時(shí)需及時(shí)換液。血清是傳統(tǒng)培養(yǎng)中的關(guān)鍵成分，但其批次差異較大，可能引入外源因子，目前無(wú)血清培養(yǎng)基（如 X-VIVO 系列）因穩(wěn)定性更優(yōu)而逐漸普及。
細(xì)胞密度過(guò)高會(huì)引發(fā)接觸抑制，過(guò)低則會(huì)導(dǎo)致增殖緩慢，通常需維持在 1×10?-2×10? cells/mL。當(dāng)細(xì)胞密度超過(guò) 3×10? cells/mL 時(shí)，需按 1:2 或 1:3 的比例進(jìn)行傳代，傳代時(shí)動(dòng)作要輕柔，避免劇烈吹打造成細(xì)胞損傷。
長(zhǎng)期擴(kuò)增可能導(dǎo)致 T 細(xì)胞表面活化受體（如 CD28）表達(dá)下降，或產(chǎn)生 PD-1 等抑制性分子，影響細(xì)胞功能?？赏ㄟ^(guò)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物（如 CD3?CD4?/CD8?比例、PD-1 表達(dá)量）監(jiān)控細(xì)胞狀態(tài)，必要時(shí)加入 PD-1 抑制劑阻斷相關(guān)信號(hào)。
培養(yǎng)箱需維持 37℃、5% CO?、95% 濕度的環(huán)境，溫度波動(dòng)若超過(guò) ±0.5℃會(huì)影響細(xì)胞代謝，CO?濃度異常則會(huì)直接改變培養(yǎng)基 pH 值。此外，應(yīng)避免頻繁開(kāi)關(guān)培養(yǎng)箱，以減少對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的干擾。
二、體外快速擴(kuò)增 T 細(xì)胞的常用方法
這是一種經(jīng)典方法：將抗 CD3 抗體（模擬 TCR 信號(hào)）和抗 CD28 抗體（提供共刺激信號(hào)）包被在培養(yǎng)瓶或磁珠上，與 T 細(xì)胞結(jié)合后啟動(dòng)活化通路，通常在 24-48 小時(shí)內(nèi)即可觀察到細(xì)胞體積增大并開(kāi)始增殖，7-10 天可實(shí)現(xiàn) 10 倍以上的擴(kuò)增。其中，磁珠法（如 Dynabeads）因細(xì)胞與抗體接觸更充分，效率比直接包被法高 2-3 倍。
采用經(jīng)照射滅活的同種異體細(xì)胞（如外周血單個(gè)核細(xì)胞 PBMC）作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，這類(lèi)細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子并提供共刺激信號(hào)，能顯著提高擴(kuò)增倍數(shù)。例如，每 1×10?個(gè) T 細(xì)胞搭配 1×10?個(gè) feeder 細(xì)胞，在 14 天左右可實(shí)現(xiàn) 50-100 倍的擴(kuò)增，但需注意 feeder 細(xì)胞的來(lái)源和滅活效果，以避免殘留活性細(xì)胞造成影響。
生物反應(yīng)器與自動(dòng)化培養(yǎng)系統(tǒng)
傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶的擴(kuò)增規(guī)模有限，生物反應(yīng)器（如攪拌式、波浪式）通過(guò)動(dòng)態(tài)培養(yǎng)提高氧氣和營(yíng)養(yǎng)交換效率，適合大規(guī)模擴(kuò)增，10L 的反應(yīng)器可實(shí)現(xiàn) 10?級(jí)別細(xì)胞產(chǎn)量。自動(dòng)化系統(tǒng)（如 CliniMACS Prodigy）能整合分選、激活、擴(kuò)增流程，減少人工操作誤差，同時(shí)通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)調(diào)整參數(shù)，比傳統(tǒng)方法提速 30% 以上。
對(duì) T 細(xì)胞進(jìn)行基因編輯（如敲除 SOCS1 基因，解除細(xì)胞因子信號(hào)抑制），或轉(zhuǎn)入永生化基因（如端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 hTERT），可延長(zhǎng)細(xì)胞增殖周期。但這種方法涉及基因改造，其應(yīng)用需嚴(yán)格評(píng)估安全性。
研究發(fā)現(xiàn)，5% 的氧濃度（接近體內(nèi)淋巴結(jié)微環(huán)境）比常氧（21%）更能促進(jìn) T 細(xì)胞增殖，且能減少活性氧（ROS）積累導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，使擴(kuò)增效率提升 20%-50%，同時(shí)還能保留細(xì)胞更強(qiáng)的相關(guān)特性。
三、總結(jié)
體外擴(kuò)增 T 細(xì)胞的核心在于平衡 “數(shù)量" 和 “質(zhì)量"—— 既要快速獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞，又要確保細(xì)胞具備良好的活性和功能。在實(shí)際操作中，需根據(jù)具體需求（如自體與異體 T 細(xì)胞的差異等）選擇合適的方法，同時(shí)通過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)控體系監(jiān)控每一步驟，為后續(xù)的相關(guān)研究或應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
更新時(shí)間：2025-08-21
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